神秘的细胞凋亡之谜，高内涵成像分析系统带您一探究竟！

材料与试剂

1. 细胞株 (SGC-7901) (中山大学细胞库)

2. 胎牛血清 (FBS) (美国 Gibco 公司, catalog number: 10270106)

3. 新生牛血清 (NBCS) (美国 Gibco 公司, catalog number: 16010142)

4. RPMI-1640 培养液 (美国 Gibco 公司, catalog number: 31870082)

5. DMEM 高糖培养液 (美国 Gibco 公司, catalog number: 11965092)

6. 溶酶体红色荧光探针 (Beyotime 生物技术有限公司, catalog number: C1046)

7. 吖啶橙 (AO) (Beyotime 生物技术有限公司, CAS number:: 494-38-2)

8. 青霉素/链霉素 (Beyotime 生物技术有限公司, catalog number: C0222)

9. RPMI-1640/DMEM (Gibco) 的配制 ( 见溶液配方 , catalog number:31800022/12800017 )

仪器设备

1. 超净工作台(苏洁医疗器械有限公司, model: SJ-CJ-2FD)

2. 二氧化碳培养箱 (日本松下电器公司, model: 371)

3. 倒置生物显微镜 (奥林巴斯公司, model: CKX31-A11RC)

4. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂, model: LDZM-60KCS-II)

5. 电热鼓风干燥箱 (上海凯朗仪器设备厂, model: DHG-9140A)

6. 低速离心机 (上海安亭科学仪器厂, model: TDL-5-A)

7. 高速冷冻离心机 (上海卢湘仪仪器有限公司, model: TGL-16M)

8. -86 °C 医用低温箱 (日本松下公司, model: MDF-193)

9. 高内涵细胞成像系统 (MOLECULAR DEVICES, model: ImageXpress Mcro XLS)

实验步骤

1. 将细胞置于 12 孔微量分析培养板 (NEST) 中。

2. 待细胞长至 40%-60%，加药 (3.5 μM ) 作用 1-2 h。

3. 细胞与染液 LysoTracker Red (150 nM，λex = 577 nm，λem = 590 nm)在 37 °C 孵育 1 h。

4. 孵育完成后，将孔板用 4 °C PBS 洗涤 3 次。

5. 洗涤完毕后，在所有孔中加入 300-500 μL/孔 PBS，将细胞在高内涵成像分析系统下成像。

开机

高内涵分析系统如图 1

1) 插电源并且打开光源等开关 (三个开关朝上，皆亮绿灯)。

2) 开电脑主机和电脑显示屏。

3) 打开软件 Matepress，输入密码：MOLDEV。

图 1. 高内涵成像分析系统外观图

批量拍照步骤

(适用于仪器稳定，细胞培养板平整的情况)

高内涵成像分析系统操作界面图 2

1) 点击开窗按钮  ，取下细胞培养板的盖子，板孔 A 对应板孔槽的右上角，放入细胞培养板，关窗。

2) 点击 screening → 点第一个选项：选择 File 名称 → 选中需要拍摄的板孔和视野 (选中即为绿色，视野最好不少于 20 个，五点取样)。

3) 点击 configure → 选取板孔样式：plate-celler 12-well-plastic 或者是 plate-celler 6-well-plastic (此处应根据所购买的细胞培养板的种类做适宜更改，选择合适的板孔样式)。

4) 选择需要拍照的通道数目及范围：绿光 (FITC)、红光 (Texas Red)、蓝光(DAPI)、明场 (TL ON)。

5) 选中所要拍摄的某个通道 → 自动曝光 (Auto exposure) → 自动聚焦(calculated offect，曝光值较大时此过程会较为缓慢) → 聚焦完毕后，弹出对话框，拉动进度条选择最为清楚的一张照片 → OK → 以同样的方法调整好每个通道的清晰度 → 点 preview 即可预览。

6) 点击 run → 更改 folder Name (例如：GYY AOEB 20200624) → 复制 folder Name，粘贴到下一行 → 点击 Acquire plate后开始拍照。从第一个板孔开始按“S”型进行拍照，若曝光值较大，则此过程较为缓慢；若一开始选择了 12 个板孔和 20 个视野，则每个板孔各拍摄 20 张图片，一共拍摄 240 张照片，第 1-20 张图片属于第一个板孔，第 21-40 张属于第二个板孔以此类推。

图 2. 高内涵成像分析系统操作界面图

批量保存图片

 (适用于保存批量拍摄的图片)

单独拍摄保存照片

(适用于仪器不够稳定及细胞培养板不平整的情况)

高内涵成像分析系统数据保存操作如图 3

与批量拍照步骤类似，打开 configure，根据所要拍摄的通道在最上方选择合适的模板 (如 hm ROS、wyj 等等)，在根据个人铺板的情况选中所要拍摄的板孔和视野，先点击 Auto exposure 自动曝光，然后点击 calculate offect 自动聚焦，在弹出的对话框中选择最清晰的一张照片，点击 OK。若此时照片还是不够清晰，则可缓慢调节自动聚焦后的参数，使图片更为清晰。或者把实时 Live 打开，缓慢调节 z 坐标轴，直至调出清晰的图片。

调出清晰的图片后，单独保存图片则遵循如下步骤：点击 Edit → display → Overlay Images →此刻弹出对话框 →按所要保存的通道选择合适的选项(例如保存 FITC 通道图片则只选择 FITC，其他通道选择 None；若同时选择 FITC 与 DAPI 通道则保存的是两个通道下的叠加图) → 点击 Apply → 右击 Save as → 命名保存于合适的文件夹 → 后面则可换孔、换视野继续如上操作。

图 3. 高内涵成像分析系统数据保存操作图

关机步骤

拍摄完毕，点击开窗按钮，取出拍摄的细胞培养板，随后关窗，防止镜头落灰。退出软件，用专用的 U 盘获取拍摄的数据，关闭计算机主机和显示屏。关闭灯源等三个开关 (绿灯灭)，最后拔掉计算机插头和光源插头 (荧光显微镜插头不拔)。

1. 将细胞置于 12 孔微量分析培养板 (NEST) 中。

2. 待细胞长至 40%-60%，加药 (3.5 μM ) 作用 4-8 h。

3. 细胞与 AO (1 μg/ml) 在 37 °C 孵育 1 h。

4. 孵育完成后，将孔板用 4 °C PBS 洗涤 3 次。

5. 洗涤完毕后，所有孔加入 300-500 μL/孔 PBS，将细胞在高内涵成像分析系统下成像(具体操作见第一点)。

结果与分析

溶酶体中含有多种水解酶，能够降解几乎所有的生物分子。溶酶体完整性的破坏可导致溶酶体膜通透性 (LMP) 启动细胞死亡 (Boya et al., 2003; Nylandsted et al., 2004; Blomgran et al., 2007; Boya and Kroemer, 2008; Repnik et al., 2014)。用 LysoTracker Red 染色法检测配位化合物在溶酶体中的位置。如图 5（A）所示，用 LysoTracker Red 染色的溶酶体显示亮红色。SGC-7901 细胞暴露于 3.5 μg/mL的配位化合物 1-3 后，配位化合物发射绿色荧光。合并暗示红色和绿色荧光重叠，表明配位化合物 1-3 靶向溶酶体。

然后用吖啶橙 (AO) 染色法观察溶酶体通透性。AO 是一种异色荧光染料，在酸性 pH 下 (在完整溶酶体中) 表现出明亮的红色荧光。当溶酶体通透性增强，进入溶酶体的 AO 红色荧光逐渐减弱 (Chang et al., 2016)。如图 5（B）所示，在对照组 (a) 中，发现绿色荧光包含多个明亮的红色荧光点。3.5 μg/mL 的配位化合物 1(b)、2 (c) 和 3 (d) 处理 SGC-7901 细胞 24 h 后红色荧光减弱，表明溶酶体通透性增强。

吖啶橙 (AO) 能透过核膜完整的细胞，与细胞 DNA 结合，使之发出明亮的绿色荧光，当细胞发生早期凋亡时，吖啶橙 (AO) 能透过胞膜完整的早期凋亡细胞，早期凋亡细胞常伴有核固缩 (Taylor et al., 2008; Marino et al., 2014; Cao et al.,2017)。如图 5B 所示，在对照组 (a) 中，发现 SGC-7901 细胞显现明亮的绿色荧光且细胞核结构完整，细胞核呈正常的米粒状。3.5 μg/mL 配位化合物 1 (b)、2 (c)和 3 (d) 处理 SGC-7901 细胞 24 h 导致核固缩，表现明显的凋亡特征，例如：细胞膜起泡、核固缩、染色质凝结。

图 4. A. SGC-7901 细胞用 3.5 μM 的复合物 1-3 处理 1 小时后，复合物在溶酶体的位置。B. SGC-7901 细胞（a）加入 3.5 μM 的复合物 1（b）、2（c）和 3（d）8 小时后，溶酶体通透性的检测，细胞用 AO 进行染色。

溶液配方

1.1 高压 1 L 超纯水、过滤装置、玻璃棒、1 L 烧杯。

1.2 称取 2.0 g 碳酸氢钠 (调 PH)，青霉素-链霉素双抗解冻。

1.3 将高压的 1 L 超纯水、过滤装置、玻璃棒、烧杯，RPMI-1640/DMEM 粉末一包放于超净台紫外 1 h。

1.4 进入超净台进行溶液配制，先倒一瓶高压后的超纯水于 1 L 烧杯中，后加入 RPMI-1640/DMEM 粉末、碳酸氢钠 2.0 g、青霉素-链霉素双抗 10 ml，充分溶解后加入另一瓶超纯水。

1.5 搭过滤装置并且检查过滤装置是否漏液。

1.6 将滤液分装于两个 500 ml 玻璃瓶内，用封口膜封口，随后拿出超净台放入 4 °C 冰箱。

1. Boya, P., Andreau, K., Poncet, D., Zamzami, N., Perfettini, J. L., Metivier, D.,  Ojcius, D. M., Jaattela, M., Kroemer, G. (2003). Lysosomal membrane  permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. J Exp  Med 197: 1323-34.

2. Blomgran, R., Zheng, L., Stendahl, O., (2007). Cathepsin‐cleaved Bid promotes  apoptosis in human neutrophils via oxidative stress‐induced lysosomal membrane permeabilization. J Leukoc Biol 81: 1213-23.

3. Boya, P., Kroemer, G. (2008). lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene 27: 6434-6451.

4. Chang, Y., Li, Y., Ye, N., Guo, X., Li, Z., Sun, G., Sun, Y. (2016). Atorvastatin  inhibits the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by  angiotensin II via the lysosomal-mitochondrial axis. Apoptosis 21: 977-996.

5. Cao, J. J., Tan, C. P., Chen, M. H., Wu, N., Yao, D. Y., Liu, X. G., Ji, L. N., Mao, Z.  W. (2017). Targeting cancer cell metabolism with mitochondria-immobilized  phosphorescent cyclometalated iridium (III) complexes. Chem Sci 8: 631-640.

6. Marino, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, E. H., Kroemer, G., (2014). Selfconsumption: the interplay of autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 15:  81-94.

7. Nylandsted, J., Gyrd-Hansen, M., Danielewicz, A., Fehrenbacher, N., Lademann,  U., Hoyer-Hansen, M., Weber, E., Multhoff, G., Rohde, M. (2004). Heat shock  protein 70 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane  permeabilization. J Exp Med 200: 425-35.

8. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. (2014). Lysosomal membranepermeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion 19: 49-57.

9. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J., (2008). Apoptosis: controlled demolitionat the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol 9: 231-41.