L-苏氨酸作为必需氨基酸，在饲料、食品和医药领域需求旺盛。系统代谢工程虽已使大肠杆菌生产 L-苏氨酸效价突破 120 g/L，却因代谢网络复杂、靶点难寻而难以兼顾效价与产率。因此，需要创新及高效的方法来加速菌株进化。
“Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l‑threonine production in Escherichia coli”是 2025 年 3 月江南大学饶志明团队发表在 Biotechnology for Biofuels and Bioproducts 上的一篇文章。该研究提出了一系列工程策略，以进一步提高 L-苏氨酸生产菌的产能。
首先，利用转录组分析筛选在大肠杆菌中能够感应外源 L-苏氨酸的启动子。
随后，通过将 CysB 突变体与 eGFP 相结合，构建了能够灵敏响应 L-苏氨酸浓度变化的荧光报告系统。
接着，利用该生物传感器辅助 FACS 和 QPix 两步高通量筛选技术，实现菌株的迭代进化，以捕获优良突变体。
进一步地，通过多组学分析鉴定有益靶点，并借助 GSMN 优化胞内碳通量分配，以最大化 L-苏氨酸产量。
本研究不仅开发出一株具有工业应用潜力的 L-苏氨酸高产菌株，还展示了构建高灵敏度 L-苏氨酸生物传感器的新方法，为开发针对其他化学品的生物传感器提供了新的思路。
为开发高灵敏 L-苏氨酸生物传感器，研究者先对 MG1655 施加 0–60 g/L 外源苏氨酸并进行转录组学分析，筛得 32 个表达量与苏氨酸正相关的基因；进一步聚焦 21 个启动子构建 eGFP 报告文库后，确认 PcysK 响应最佳并呈线性，但天然元件阈值窄、假阳性高，需后续优化。
为克服天然传感器灵敏度低、阈值窄的缺陷，研究对“cys”系列启动子进行人工改造：
删除 CysB 结合位点后，L-苏氨酸响应完全消失，证实 CysB 是必需调控因子。
随后，在灵敏度更高的 pTrc99A-PcysK-egfp 质粒中过表达 CysB，构建“pSensor，其线性区间被压缩至 0–4 g/L，灵敏度提高 2.1 倍。
分子对接和定点突变锁定 CysB-T102 为关键位点，T102A 突变体“pSensorThr”响应阈值再升 2.4 倍，且能可靠区分高产（THR36-L19）与无产（THR01）菌株。
与现有系统相比，pSensorThr 误筛风险低但响应范围仍窄，需进一步优化响应范围以扩大适用性。
将温度敏感突变质粒 MP6ts 导入 THR36-L19，在 30 °C 诱变、42 °C 去质粒，快速构建大规模突变文库；随后引入 pSensorThr 并用 FACS、QPix 高通量筛选设备进行 5 轮“突变-筛选”循环，共挑出 50 株高产荧光突变株。摇瓶验证显示多数菌株产量优于出发菌，其中 THRM1 产量最高，达 38.97 g/L。
QPix 在菌株筛选中起到了挑菌标准化/解放手工/高效挑菌的作用。
多组学指导的逆向代谢工程进一步提升 L-苏氨酸产量
THRM1 高产源于“Tpx C61G”与“SpoT R290H→H290R 回复”两突变：产率提升≈3%。此外，敲除 tpx 或 spoT 分别微增或严重降产，证实二者作用。其余 4 个突变无显著贡献。转录组显示 THRM1 重调碳流：EMP 与乙醛酸途径上调、TCA 下调，pps 高表达补充 PEP；但 pykF、poxB、pflB 过表达造成碳流失。依次敲除这三基因，THRM6 产量升至 41.36 g/L。这些发现明确了关键遗传靶点，也为后续进一步提升产量提供了方向。
图 6：基于多组学分析的逆向代谢工程解析 L-苏氨酸高产机制
通过计算机模拟优化代谢通量以最大化 L-苏氨酸产量
基于 iML1515 模型的 FBA 与 OptKnock 联合预测，锁定并验证两条增产途径：
氨基供应瓶颈——模拟显示 gdhA 通量需上调；构建 RBS 文库精细调控 GdhA 表达，THRM7 产量升至 44.12 g/L。
副产/外排基因敲除——将扩展后的 GSMN 与 OptKnock 结合预测 ydbK、ompN、aroL、phoA、puuE 5 个基因为敲除靶点，实验证实 ompN 敲除 和 phoA 敲除对菌株产量有效；组合后的 THRM13 摇瓶产量 46.02 g/L，5 L 罐补料分批发酵达 163.2 g/L,得率 0.603 g/g 葡萄糖，创大肠杆菌 L-苏氨酸报道的最高纪录。研究为后续天冬氨酸家族衍生物高产提供了系统化策略。
本研究开发了一种高灵敏度、高荧光阈值的生物传感器，并用于高通量平台筛选优异突变株。通过多组学分析指导的逆向代谢工程和计算机模拟，使工程菌株 THRM13 在 5 L 发酵罐中达到 163.2 g/L 的 L-苏氨酸产量，糖酸转化率为 60.3%，为迄今在不使用外源诱导剂和抗生素条件下报道的最高水平。此外，该高通量筛选策略仍可继续用于菌株的后续迭代进化。
