在农业生产中，害虫对杀虫剂的抗性如同“超级细菌”对抗生素的耐药性，已成为全球性难题，每年造成巨额经济损失，威胁粮食安全。
其中，年销售额超 20 亿美元的二酰胺类杀虫剂（如氯虫苯甲酰胺 / CHL、氟苯虫酰胺 / FLU、四氯虫酰胺 / TET）因其高效、低毒、独特的作用机制——靶向昆虫的兰尼碱受体（RyR）而备受青睐。然而，随着广泛使用，害虫抗性问题日益突出，亟需深入理解其作用与抗性机制以指导新药开发。天津大学医学部药物科学与技术学院及合成生物前沿科学中心的尉迟之光团队与英属哥伦比亚大学的 Filip Van Petegem 团队合作在 Nature Communications 发表了一篇题为：Cryo-EM structures of ryanodine receptors and diamide insecticides reveal the mechanisms of selectivity and resistance。
RyRs：细胞内钙信号的“守门人”
RyRs 离子通道广泛存在于动物细胞中，昆虫通常只有一种 RyR 亚型，而哺乳动物有三种。它们在细胞内钙离子信号传导中扮演着至关重要的角色。钙离子作为细胞内的“第二信使”，参与调节多种细胞活动，如肌肉收缩、神经信号传递、细胞分裂等。RyRs 离子通道通过控制钙离子从肌浆网和内质网等细胞内钙储存库的释放，精细地调节细胞内的钙离子浓度，从而影响细胞的生理功能。二酰胺类杀虫剂的神奇之处在于，它们能高选择性地结合并异常激活昆虫的 RyR，导致细胞内钙离子不受控制地大量释放（“钙失控”），引发害虫肌肉持续收缩、麻痹、停止取食直至死亡。
研究团队的核心突破一：冷冻电镜“定格”杀虫剂与通道的共舞
研究团队面临的一大挑战是难以大量纯化天然的昆虫 RyR 进行结构研究。他们创造性地设计了一种嵌合 RyR (chiRyR)，将重要农业害虫草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) RyR 中负责结合二酰胺类杀虫剂的“口袋”区域，移植到更易研究的兔源 RyR1 (rRyR1) 上。这种嵌合体完美保留了昆虫 RyR 对二酰胺类杀虫剂的高亲和力。利用高分辨率冷冻电镜技术，研究人员成功解析了嵌合 RyR 分别与两种代表性二酰胺类杀虫剂——氟苯虫酰胺（FLU，邻苯二甲酸二酰胺类）和四氯虫酰胺（TET，邻氨基苯甲酸二酰胺类）结合的复合物结构（图2）。
图 2
核心突破二：抗性突变如何让“钥匙”打不开“锁”？
研究团队将这两个关键抗性突变引入嵌合 RyR 中，并利用荧光法检测内质网钙离子浓度变化（[Ca²⁺] ER measurement）和 [³H] 雷尼丁结合实验进行功能验证。结果非常震撼：
携带双突变的嵌合 RyR 对 CHL 的敏感性降低了超过 5000 倍！对 FLU 的活性则几乎完全丧失（图 4b,c）。
图 4b
图 4C
通过冷冻电镜，科学家们能够清晰地观察到 RyRs 在不同状态下的结构变化，以及杀虫剂分子是如何与 RyRs 的特定区域相互作用的。这种结构信息对于理解杀虫剂的选择性作用机制至关重要。
FlexStation 3：精准捕捉“钙失控”动态，量化杀虫效力与抗性的关键利器
与此同时，细胞内钙离子的动态变化是评估 RyRs 功能和杀虫剂作用效果的关键指标。Molecular Devices 的 FlexStation 3 钙离子检测工作站凭借其卓越的检测性能，在这一研究中发挥了不可或缺的作用。
FlexStation 3 能够快速、准确地测量细胞内钙离子浓度的变化，为科学家们提供实时的钙离子动态数据。通过荧光探针技术，
FlexStation 3 可以检测到细胞内钙离子浓度的微小变化，从而反映出 RyRs 通道的活性状态以及杀虫剂对钙离子释放的影响。
在整个研究过程中，特别是在评估不同 RyR 构建体（野生型、嵌合体、突变体）对杀虫剂的敏感性（EC50 值）和验证嵌合体功能方面，Molecular Devices 公司的 FlexStation 3 多功能微孔板检测系统发挥了不可或缺的关键作用（图 1b, 4b）。
图 1b
图 4b
01
实时、动态监测钙流：
研究利用了一种基因编码的内质网钙指示剂（R-CEPIA1er）表达在 HEK293 细胞中。当 RyR 被杀虫剂激活时，内质网中的钙离子释放，导致 R-CEPIA1er 的荧光信号（激发 560nm，发射 610nm）发生特定变化（F/F0 比值下降，反映内质网钙浓度降低）。FlexStation 3 凭借其精确的温控、自动化的液体加样和快速、灵敏的光学检测系统，能够高通量（96 孔板）地实时监测这一荧光动态变化过程（每 10 秒记录一次，持续 300 秒）。这种实时、定量的钙流动力学监测是获得可靠 EC50 值的基础。
02
高灵敏度与精确剂量响应：
FlexStation 3 能够精确地添加不同浓度的杀虫剂（从 nM 到 μM 范围）和对照化合物（如咖啡因），并高灵敏度地捕捉到由低浓度杀虫剂引发的微弱钙信号变化。这对于确定杀虫剂对高敏感性昆虫 RyR（EC50 在 nM 级）和低敏感性哺乳动物 RyR 或抗性突变 RyR（EC50 在 μM 级）的效力差异至关重要。研究显示，FLU 和 TET 对昆虫 RyR (Sf RyR) 的 EC50 分别为 59.3 nM 和 174.5 nM，而对兔 RyR1 的 EC50 则高达 4.5 μM 和 7.6 μM，选择性差异超过 100 倍。嵌合 RyR 成功模拟了昆虫 RyR 的高亲和力（EC50~25-46 nM），而抗性突变则使 EC50 飙升到 μM 级。
03
验证嵌合体功能：
在结构研究之前，利用 FlexStation 3 进行的钙流检测首先确认了设计的嵌合 RyR 完全再现了天然昆虫 RyR 对二酰胺类杀虫剂的高亲和力和激活特性，为后续冷冻电镜研究的生物学相关性提供了坚实的功能学基础。同时，该技术也用于确认抗性突变体 RyR 对咖啡因等基础激活剂的反应基本正常，表明突变主要影响杀虫剂特异性结合而非通道基本功能。
这项研究的意义重大
01
阐明作用机制：
首次在原子水平揭示了不同家族二酰胺类杀虫剂与昆虫 RyR 的结合细节和激活通道的精确分子机制。
02
破解抗性根源：
清晰阐明了最常见田间抗性突变（I4790M/G4946E）通过改变结合口袋的物理化学性质（形状、电荷）和稳定通道关闭状态来赋予高抗性的双重机制，并解释了为何邻氨基苯甲酸类对某些抗性相对更有效。
03
提供设计蓝图：
这些高分辨率结构为基于结构的理性药物设计（SBDD）下一代杀虫剂铺平了道路。
04
验证关键技术：
嵌合 RyR 策略结合冷冻电镜是研究难表达膜蛋白靶标的有力工具。Molecular Devices FlexStation 3 为代表的实时、高通量钙流检测技术，则为靶标功能验证、化合物效力与抗性评估提供了强大、可靠且高效的技术支撑，是连接结构生物学发现与真实世界生物学表型的关键桥梁。
害虫抗药性的战争远未结束。这项发表在 Nature Communications 上的突破性工作，如同照亮迷雾的灯塔，不仅深刻揭示了明星杀虫剂的作用与抗性之谜，更借助冷冻电镜和 FlexStation 3 等先进技术的力量，为设计更高效、更安全、能有效克服抗性的下一代绿色杀虫剂绘制了精确的“分子蓝图”。随着这些基于结构的新策略的应用，我们有望在保障粮食安全的征程中，赢得更可持续的主动权。
