背景介绍
活性氧（reactive oxygen species, ROS）是含有有氧细胞代谢产生的氧的化学活性分子。这些化学物质参与各种细胞过程，例如信号传导、稳态和免疫防御。然而，在环境压力下，细胞内的 ROS 水平会急剧增加，并导致脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤[1]。这些改变会导致各种病理事件，例如男性不育、癌变和许多其他生理状况[2]。
荧光探针通常用于测量细胞内的 ROS 水平，其中绿色荧光探针最受欢迎。然而，绿色荧光范围内的检测和成像可能会受到细胞自发荧光的影响[3]。使用远红外和近红外（NIR）荧光染料来测量 ROS 水平则避免细胞自发荧光的干扰。
SpectraMax® iD 系列多功能微孔板读板仪采用专利的超冷却 PMT 和 4 光栅光路设计，可减少信号背景和杂散光。这些特性为远红外荧光检测提供了宽动态范围和灵敏度。
在此，我们演示了如何使用 SpectraMax iD5 微孔板读板仪通过两个荧光测定试剂盒测量细胞内 ROS 水平。使用光谱优化向导（Spectral Optimization Wizard）功能，我们优化了远红外分析的激发波长和发射波长组合。最后，我们比较了绿色荧光测定和远红外荧光测定之间的测定性能。
材料
Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit *Deep Red Fluorescence* (AAT Bioquest cat. #22903)
Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit *Green Fluorescence* (AAT Bioquest cat. #22900)
HEK293 cells (AATC cat. #CRL-1573)
Menadione (Sigma cat. #M9429-25G)
96-well tissue culture-treated, clear bottom, black-walled plates (Greiner cat. #655087)
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices cat. #iD5)
方法
将 HEK293 细胞以每孔 10,000 个细胞接种到几个经细胞培养处理的 96 孔微孔板中，并让细胞在 37°C 培养箱中恢复 24 小时。之后，用 2 倍梯度稀释的甲萘醌处理细胞，浓度从 25 μM 开始，处理 1 小时。处理后，向细胞中加入 Cell Meter Deep Red ROS 检测试剂或 Cell Meter Green 荧光 ROS 检测试剂，并将板在 37°C 下孵育 30 分钟。
由于激发波长和发射波长之间很接近，Cell Meter Deep Red ROS 检测的推荐波长对（658/675）与 SpectraMax iD5 微孔板读板仪不兼容。在这个实验中，我们估计了 625/700 波长对以便激发和发射光栅带宽之间有足够的距离，同时产生充足的荧光信号（图 1）。
图 1：远红外荧光光谱。Cell Meter Deep Red ROS 分析的激发和发射光谱如上所示。红色虚线表示激发光谱峰值在 650 nm 处，红色实线代表发射光谱峰值在 675 nm 处。灰色阴影条表示用于进行分析的选定未优化波长对，以及它们相关的 15 nm（激发）和 25 nm（发射）光栅带宽
SoftMax® Pro 软件的光谱优化向导用于自动计算远红外分析的最佳激发和发射波长对。此外，“读取高度优化”功能用于确定分析的最佳读取高度。实验中使用的波长和 PMT 增益如表 1 所示。数据和图表是使用 SoftMax Pro Software 生成的。
表 1：检测的波长和 PMT 设置
结果
甲萘醌通过中断线粒体电子传递链的各个部分导致细胞 ROS 积累[4]，因此我们预计细胞内 ROS 水平会随着甲萘醌浓度的增加而增加。绿色荧光和远红外荧光测定试剂盒均产生具有相似 EC50 值的甲萘醌剂量反应曲线（图 2 和 3）。光谱优化向导的远红外分析波长组合提供了最佳的 Z' 因子（表 2）。
图 2：绿色荧光细胞内 ROS 测量。使用 Cell Meter Green 荧光细胞内 ROS 测定法测定甲萘醌处理的 HEK293 细胞，并在 SoftMax Pro 软件中生成 4 参数剂量反应曲线。根据数据计算出 EC50 为 1.86 μM
图 3：远红外荧光细胞内 ROS 测量。与用户估计的波长对相比，光谱优化向导确定的波长对（浅蓝色）产生的分析窗口更大。EC50 值为 2.10 μM 和 2.21 μM，分别由光谱优化的波长对和用户估计的波长对计算得出
表 2：Cell Meter 远红测定的剂量反应和 Z' 因子表。从每次检测中计算的 EC50 值相似，并且每次检测都显示 Z' 因子远高于 0.5，表明检测是稳定的
结论
SpectraMax iD5 多功能微孔板读板仪与 SoftMax Pro 软件相结合，是荧光测量细胞内 ROS 水平的出色工具。SoftMax Pro 软件中的光谱优化向导和读取高度优化功能可自动优化分析条件以获得最佳结果。尽管 SpectraMax iD5 读板仪能够有效地检测这两种检测，但具有优化激发和发射波长的远红检测显示出比基于绿色荧光的检测略好的 Z' 因子。
目前 Molecular Devices 公司配备光谱优化向导（Spectral Optimization Wizard）功能的读板仪主要包括：SpectraMax iD3，SpectraMax iD5，这两款读板仪将分别被新上市的 SpectraMax iD3s 和 SpectraMax iD5e 取代，另外，SpectraMax i3x 以及 SpectraMax Paradigm 的 Tunable Wavelength（TUNE）检测卡盒也可使用 Spectral Optimization Wizard 功能。
参考文献
[1]. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways." Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50.
[2]. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi:10.1186/1742-4933-5-13.
[3]. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene." Nature Methods 8.9 (2011): 726.
[4]. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinskiĭ. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DT-diaphorase function." Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991): 1779-1786.
