化妆品原材料的发展及如何利用微孔板读板机对其进行毒理和功效学的评价

理化检验（pH 值、重金属、禁用原料等）

微生物检验（菌落总数、致病菌等）

人体安全性检验（皮肤斑贴试验、试用试验）

毒理学试验（刺激性、光毒性、生殖毒性等）

人体功效评价检验（防晒测试、防水测试、美白测试等）

化妆品原料传统评价方法（毒理学试验和功效评价）

化妆品原料基于 Cell-Based Assay 的评价方法（毒理学试验和功效评价）

MTT 法是一种常用的细胞活性测定方法。MTT（噻唑蓝）是一种黄色的四唑盐，具有很好的水溶性。活性细胞内的线粒体含有脱氢酶，这些酶能将 MTT 还原为不溶于水的紫色甲臜（formazan）晶体。形成的甲臜晶体可以通过溶剂溶解，将其溶解在溶液中后，可以使用酶标仪在特定波长下测量其吸光度。吸光度的大小与活细胞的数量成正比，通过测量吸光度，可以推断出细胞活性或细胞存活率。

图 1. MTT 法测细胞活力原理。

ATP 法是最常见的细胞活力筛选方法之一，其基于测量广泛认可的活细胞标志物 - ATP 的水平。细胞膜的完整性破坏后，其很快丧失合成 ATP 的能力，同时胞浆的 ATP 会被迅速降解。ATP 的检测依赖于经典的萤火虫发光公式，最常见的是来源于 Promega 的 CellTiter-Glo 法。

图 2. 萤火虫发光公式。

相较于传统的代谢法，ATP 法主要有以下几个优势：

TRPV1（Transient Receptor Potential Vanilloid 1）是一种离子通道蛋白，属于瞬时受体电位（TRP）通道家族。它主要存在于感觉神经元中，对温度变化、酸性环境和辣椒素等刺激非常敏感。David Julius 由于在“发现温度和触觉感受器”方面作出的贡献，与 Ardem Patapoutian 共享了 2021 年诺贝尔生理学或医学奖，其中 TRPV1 通道是其主要发现之一。

激活 TRPV1 通道会导致细胞内钙水平上升，并导致皮肤中的免疫细胞包括 T 细胞和嗜酸性粒细胞被激活，从而释放促炎因子。这些免疫反应最终表现为临床症状，如瘙痒、灼烧感或刺痛感。

在敏感皮肤受损屏障中激活 TRPV1 会阻碍屏障修复，使用 TRPV1 拮抗剂来抑制 TRPV1 信号则有助于屏障修复。

图 3^[1]. 敏感肌肤的病理生理学过程。

图 4^[2]. TRPV1 通道的信号通路。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是一类由细胞有氧代谢产生的具有化学反应活性的一类含氧分子，参与细胞信号转导、免疫防御以及维持体内动态平衡等各项生理活动。然而当细胞处于环境压力时，胞内的 ROS 含量水平就会急剧上升造成核酸、蛋白和脂类物质的氧化损伤，从而引起许多生理、病理变化，诸如男性不育、癌症的发生等等。

通过检测细胞内活性氧（ROS）水平、抗氧化酶活性等指标，可以评估化妆品原料的抗氧化能力。

图 5. 绿色荧光检测胞内 ROS。经甲萘醌处理的 HEK 293 细胞采用 Cell Meter 绿色荧光 ROS 检测试剂盒检测，4 参数剂量反应曲线由 SoftMax^® Pro 软件获得，经计算 EC50 为 1.86 μM。

黑色素是皮肤中的重要色素，由黑色素细胞产生，能够吸收紫外线从而保护皮肤。适量的黑色素可以作为天然防晒剂，提供保护屏障的功能。然而过多的黑色素沉积可能对皮肤产生不良影响。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）是一种存在于黑色素细胞中的酶，负责催化酪氨酸和左旋多巴转化为黑色素。在皮肤黑色素合成过程中，酪氨酸酶具有关键作用。

通过研究化妆品原料对黑色素细胞的影响，如检测黑色素的合成量、酪氨酸酶活性等，可以用于评价化妆品原料的美白功效。

图 6^[3]. 使用酶标仪在 475 nm 波长下检测 OD 值，每 3 min 读取一次，动态检测 60 min 内 OD 值。然后通过计算最大吸光度速率变化，可以推算出酪氨酸酶活性。

图 7^[3]. 通过显微成像的方式，分别测定（A）BC：空白组（B）NC：α－MSH 组（C）PC：熊果苷组（D）测试原料1：光甘草定组（E）测试原料2：传明酸五组样品的细胞内黑色素含量。

成纤维细胞能够合成胶原蛋白和弹性纤维，是皮肤保持弹性和紧致的关键细胞。胶原蛋白是维持人类皮肤健康的重要组成部分，因为它提供结构支持、弹性、紧致度和柔韧性。胶原酶是降解皮肤中胶原蛋白的酶，随着年龄的增长，会导致皱纹的形成。因此，具有抑制这种酶潜力的化合物可以延缓皱纹形成，从而延缓衰老。因此，用于量化抗胶原酶作用的试验被用于分析不同化合物的抗衰老活性。

把胶原酶提取出来后，使用酶标仪在 340 nm 处测量样品吸光度的变化，并通过绘制样品浓度（x 轴）与抑制百分比（y 轴）的线性回归曲线，可以计算半数抑制浓度（IC50）值，评价抗胶原酶的作用效果。

图 8^[4]. (A) 开发的脂质体中葫芦巴提取物的包封示意图及其对皮肤的预期效果

(B) 葫芦巴提取物未包封（“Extract”）和包封在开发的脂质体中的胶原酶抑制试验结果（“LNF”）

(C) 使用葫芦巴提取物（及对照）处理后的胶原蛋白生成情况；* p < 0.05，*** p < 0.001。

透明质酸（Hyaluronic Acid）是一种天然存在于人体内的多糖，广泛存在于结缔组织、皮肤和眼睛等部位。其具有极强的保水能力，有助于保持皮肤的水分和弹性。

透明质酸酶（HAase）能够通过切割糖苷键，从而催化透明质酸（HA）的降解反应，因此通过检测角质形成细胞内透明质酸酶的抑制作用，可以评估化妆品原料的保湿能力，即是否能够提高皮肤的水分含量。

使用酶标仪在 600nm 波长下检测不同浓度样品的吸光度可以计算出样品对透明质酸酶（HAase）的抑制率。

图 9^[5]. A-G 代表不同浓度的化合物对透明质酸酶活性的抑制作用。该研究表明，齐墩果酸 Oleanolic acid（OA）衍生物可以与透明质酸酶蛋白结合并改变其二级结构，从而降低酶活性，因此其具有保湿美容化妆品的功效。